Pemotongan DNA oleh Enzim

Enzim restriksi

Enzim restriksi atau endonuklease restriksi adalah enzim yang memotong molekul DNA. Enzim ini memotong DNA pada rangka gula-fosfat tanpa merusak basa. Setiap enzim mempunyai sekuens pengenalan yang unik pada utas DNA, biasanya sepanjang 4-6 pasang basa.

Panjang dari sekuen pengenalan memengaruhi seringnya enzim restriksi memotong DNA dalam ukuran tertentu. Misalnya pada enzim yang memiliki panjang 4 basa, enzim ini diperkirakan akan memotong setiap 256 nukleotida. Perhitungan tersebut diperoleh dengan mengasumsikan setiap basa mempunyai kemungkinan yang sama untuk muncul, yaitu sebesar 1/4 (kemungkinan muncul 1 dari 4 basa). Jadi jika sekuen pengenalan mempunyai panjang 6 basa, maka perhitungannya menjadi: (1/4)6 = 1/4096. Perhitungan ini hanya sebagai perkiraan, pada kenyataannya belum tentu demikian. Beberapa sekuen bisa jadi lebih sering atau lebih jarang ditemui dalam suatu organisme. Seperti pada mamalia, sekuen CG sangat jarang ditemui sehingga enzim HpaII yang mempunyai sekuen pengenalan CCGG akan lebih jarang memotong pada DNA mamalia.

Enzim restriksi yang mempunyai sekuen pengenalan yang pendek akan menghasilkan banyak potongan DNA; sedangkan jika mempunyai sekuen pengenalan yang panjang, akan dihasilkan potongan DNA yang lebih sedikit. Baik enzim yang mempunyai sekuen pemotongan pendek maupun panjang, mempunyai fungsi masing-masing dalam rekayasa genetika.

Beberapa enzim sering yang digunakan dalam laboratorium dibagi menjadi tiga berdasarkan perkiraan pemotongan:

6-cutters
Ezim restriksi yang tergolong dalam 6-cutters memiliki situs pemotongan yang spesifik pada 6 nukleotida. Ezim ini cocok digunakan untuk pekerjaan kloning sehari-hari karena enzim ini lumayan sering memotong satu atau dua situs pada plasmid, namun jarang memotong bagian penting seperti titik asal replikasi (origin of replication) atau gen resisten ampisilin.Contoh enzim 6-cutters adalah HindIII (A AGCTT) yang memotong genome bakteriofage lambda (48 kbp) pada 7 situs

8-cutters
Enzim restriksi ini mempunyai situs pengenalan sepanjang 8 nukleotida; cocok digunakan untuk membentuk kromosom menjadi potongan-potongan yang spesifik dalam ukuran yang besar. Sebagai contoh: PacI (enzim 8-cutters) memotong-motong kromosom E. coli menjadi 20 bagian, sedangkan BamHI (enzim 6-cutters) memotong sekitar 300 bagian. Jika langsung menggunakan enzim 6-cutters, maka fragmen yang dihasilkan terlalu kecil dan banyak. Untuk itu digunakan enzim 8-cutters terlebih dahulu, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan enzim 6-cutters.

4-cutters
Enzim restriksi ini cocok untuk percobaan yang menginginkan pemotongan pada beberapa situs yang potensial. Contohnya: jika ingin mengumpulkan fragmen DNA secara acak, dan pada potongan tersebut terdapat gen yang diinginkan; dapat dilakukan digestsi parsial (partial digestion) menggunakan enzim 4-cutters.

Hasil Pemotongan Enzim Restriksi
Enzim restriksi yang biasa digunakan dalam laboratorium biologi molekuler memotong molekul DNA pada situs pengenalan dan menghasilkan salah satu dari ketiga jenis pola hasil pemotongan. Ketiga pola hasil pemotongan enzim restriksi sebagai berikut:

Ujung menggantung 5’
Enzim restriksi memotong secara asimetris pada situs pemotongan, menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada ujung 5’. Contoh enzim yang menghasilkan ujung menggantung 5’ adalah BamHI

Ujung menggantung 3’
Enzim restriksi ini juga memotong secara asimetris pada situs pengenalan, namun menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada ujung 3’. Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah KpnI

Ujung tumpul
Enzim ini memotong secara simetris antara kedua utas DNA sehingga menghasilkan ujung tumpul. Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah SmaI

Pola ujung menggantung, baik yang 3’ ataupun 5’, sering disebut juga dengan ujung lengket (sticky ends) atau ujung kohesif (cohesive ends). Pola seperti ini lebih mudah menempel (annealing) dengan pasangan DNA nya karena adanya ikatan basa antara ujung-ujung yang menggantung.